Des produits
Kit de détection Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR pour 2019-nCoV
Utilisation prévue
Ce kit est utilisé pour la détection qualitative du nouveau coronavirus (2019-nCoV) à l'aide d'écouvillons de gorge, d'écouvillons nasopharyngés, de liquide de lavage bronchoalvéolaire, d'expectorations. Le résultat de détection de ce produit est uniquement à titre de référence clinique et il ne doit pas être utilisé comme seul preuves pour le diagnostic clinique et le traitement. Une analyse complète de l'état est recommandée en combinaison avec les manifestations cliniques du patient et d'autres tests de laboratoire.
Principe de contrôle
Le kit est basé sur la technologie RT-PCR en une étape.En fait, les gènes ORF1ab et N du nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) ont été sélectionnés comme régions cibles d'amplification.Des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes (les sondes du gène N sont marquées avec FAM et les sondes ORF1ab sont marquées avec HEX) sont conçues pour détecter l'ARN du nouveau type de coronavirus 2019 dans les échantillons.Le kit comprend également un système de détection de contrôle interne endogène (sonde de gène de contrôle interne marquée avec CY5) pour surveiller le processus de prélèvement d'échantillons, d'amplification d'ARN et de PCR, réduisant ainsi les faux résultats négatifs.
Composants principaux
| Composants | Volume（48T/Kit） |
| Solution de réaction RT-PCR | 96µl |
| Mélange de sondes TaqMan d'amorce nCOV (ORF1ab, gène N, gène RnaseP) | 864µl |
| Contrôle négatif | 1500µl |
| nCOV Contrôle positif (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Réactifs propres : Réactifs d'extraction ou de purification d'ARN.Contrôle négatif/positif : le contrôle positif est l'ARN contenant le fragment cible, tandis que le contrôle négatif est de l'eau sans acide nucléique.Lors de leur utilisation, ils doivent participer à l'extraction et doivent être considérés comme infectieux.Ils doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations en vigueur.
Le gène de référence interne est le gène RnaseP humain.
Conditions de conservation et date de péremption
-20 ± 5 ℃, évitez la congélation et la décongélation répétées plus de 5 fois, valable 6 mois.
Instrument applicable
Avec FAM / HEX / CY5 et autres instruments PCR fluorescents multicanaux.
Exigences relatives aux spécimens
1. Types d'échantillons applicables : écouvillons de gorge, écouvillons nasopharyngés, liquide de lavage bronchoalvéolaire, crachats.
2. Prélèvement d'échantillons (technique aseptique）
Écouvillon pharyngé : Essuyez les amygdales et la paroi pharyngée postérieure avec deux écouvillons en même temps, puis plongez la tête de l'écouvillon dans un tube à essai contenant la solution d'échantillonnage
Crachats : après que le patient a une toux profonde, recueillir les crachats de toux dans un tube à essai à bouchon à vis contenant la solution d'échantillonnage ;liquide de lavage broncho-alvéolaire：Prélèvement par des professionnels de la santé.3. Stockage et transport des échantillons
Les échantillons destinés à l'isolement du virus et aux tests d'ARN doivent être testés dès que possible.Les spécimens qui peuvent être détectés dans les 24 heures peuvent être stockés à 4℃ ;ceux qui ne peuvent pas être détectés dans les 24
les heures doivent être stockées à -70 ℃ ou en dessous (s'il n'y a pas de condition de stockage de -70 ℃, elles doivent être
temporairement stocké à -20℃réfrigérateur).Les échantillons doivent éviter les congélations et décongélations répétées pendant le transport.Les échantillons doivent être envoyés au laboratoire dès que possible après le prélèvement.Si les échantillons doivent être transportés sur de longues distances, le stockage de glace carbonique est recommandé.
Méthodes d'essai
1 Traitement des échantillons et extraction d'ARN (zone de traitement des échantillons)
Il est recommandé de prélever 200 μl d'échantillon liquide pour l'extraction de l'ARN.Pour les étapes d'extraction connexes, reportez-vous aux instructions des kits d'extraction d'ARN commerciaux.Tant le négatif que le négatif
les témoins de ce kit ont été impliqués dans l'extraction.
2 Préparation des réactifs PCR (zone de préparation des réactifs)
2.1 Retirer tous les composants du kit et décongeler et mélanger à température ambiante.Centrifuger à 8 000 tr/min pendant quelques secondes avant utilisation ;calculer la quantité requise de réactifs et le système réactionnel est préparé comme indiqué dans le tableau suivant :
| Composants | N portion (système de 25µl) |
| Amorce nCOV Mélange de sondes TaqMan | 18 µl × N |
| Solution de réaction RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = nombre d'échantillons testés + 1 (témoin négatif) + 1 (nCOVcontrôle positif) | |
2.2 Après avoir soigneusement mélangé les composants, centrifuger pendant une courte période pour laisser tout le liquide sur la paroi du tube tomber au fond du tube, puis aliquoter le système d'amplification de 20 µl dans le tube PCR.
3 Échantillonnage (zone de préparation des échantillons)
Ajouter 5μl des contrôles négatifs et positifs après extraction.L'ARN de l'échantillon à tester est ajouté au tube de réaction PCR.
Boucher hermétiquement le tube et centrifuger à 8 000 tr/min pendant quelques secondes avant de le transférer dans la zone de détection d'amplification.
4 Amplification PCR (zone de détection amplifiée)
4.1 Placez le tube de réaction dans la cellule d'échantillon de l'instrument et réglez les paramètres comme suit :
| organiser | Cycle nombre | Température(°C) | Temps | collectionplacer |
| Inversetranscription | 1 | 42 | 10 minutes | - |
| Pré-dénaturationn | 1 | 95 | 1 minute | - |
| Cycle | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | collecte de données |
Sélection du canal de détection de l'instrument : Sélectionnez le canal FAM、HEX、CY5 pour le signal de fluorescence.Pour référence fluorescent NONE, veuillez ne pas choisir ROX.
5 Analyse des résultats (veuillez vous référer aux instructions expérimentales de chaque instrument pour le réglage)
Après la réaction, enregistrez les résultats.Après l'analyse, ajustez la valeur de départ, la valeur de fin et la valeur de seuil de la ligne de base en fonction de l'image (l'utilisateur peut ajuster en fonction de la situation réelle, la valeur de départ peut être définie sur 3 à 15, la valeur de fin peut être définie sur 5~20, réglage) dans le graphique logarithmique Au seuil de la fenêtre, la ligne de seuil est dans la phase logarithmique et la courbe d'amplification du contrôle négatif est une ligne droite ou en dessous de la ligne de seuil).
6 Contrôle de qualité (un contrôle procédural est inclus dans le test) Contrôle négatif : aucune courbe d'amplification évidente pour les canaux de détection FAM, HEX, CY5
Contrôle positif COV : courbe d'amplification évidente des canaux de détection FAM et HEX, valeur Ct≤32, mais pas de courbe d'amplification du canal CY5 ;
Les exigences ci-dessus doivent être remplies simultanément dans la même expérience ;sinon, l'expérience n'est pas valide et doit être répétée.
7 Détermination des résultats.
7.1 S'il n'y a pas de courbe d'amplification ou de valeur Ct> 40 dans les canaux FAM et HEX de l'échantillon à tester, et qu'il y a une courbe d'amplification dans le canal CY5, on peut juger qu'il n'y a pas de nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) ARN dans l'échantillon ;
.2 Si l'échantillon à tester présente des courbes d'amplification évidentes dans les canaux FAM et HEX et que la valeur Ct est ≤ 40, on peut juger que l'échantillon est positif pour le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si l'échantillon de test a une courbe d'amplification claire uniquement dans un canal de FAM ou HEX, et que la valeur Ct est ≤ 40, et qu'il n'y a pas de courbe d'amplification dans l'autre canal, les résultats doivent être retestés.Si les résultats du nouveau test sont cohérents, l'échantillon peut être jugé positif pour le nouveau
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Si le résultat du nouveau test est négatif, il peut être jugé que l'échantillon est négatif pour le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valeur de jugement positif
La méthode de la courbe ROC est utilisée pour déterminer la valeur CT de référence du kit et la valeur de référence du contrôle interne est de 40.
Interprétation des résultats des tests
1.Chaque expérience doit être testée pour les contrôles négatifs et positifs.Les résultats des tests ne peuvent être déterminés que lorsque les contrôles répondent aux exigences de contrôle de la qualité
2. Lorsque les canaux de détection FAM et HEX sont positifs, le résultat du canal CY5 (canal de contrôle interne) peut être négatif en raison de la concurrence du système.
3.Lorsque le résultat du contrôle interne est négatif, si les canaux de détection FAM et HEX du tube à essai sont également négatifs, cela signifie que le système est désactivé ou que l'opération est erronée, le test n'est pas valide.Par conséquent, les échantillons doivent être retestés.
