Des produits
Kit de détection Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR pour 2019-nCoV
Utilisation prévue
Ce kit est utilisé pour la détection qualitative du nouveau coronavirus (2019-nCoV) à l'aide de prélèvements de gorge, de prélèvements nasopharyngés, de liquide de lavage broncho-alvéolaire et d'expectorations. Le résultat de détection de ce produit est uniquement à titre de référence clinique et ne doit pas être utilisé comme seul preuves pour le diagnostic clinique et le traitement. Une analyse complète de la maladie est recommandée en combinaison avec les manifestations cliniques du patient et d'autres tests de laboratoire.
Principe de contrôle
Le kit est basé sur la technologie RT-PCR en une étape.En fait, les gènes ORF1ab et N du nouveau coronavirus (2019-nCoV) 2019 ont été sélectionnés comme régions cibles d’amplification.Des amorces spécifiques et des sondes fluorescentes (les sondes du gène N sont marquées avec FAM et les sondes ORF1ab sont marquées avec HEX) sont conçues pour détecter l’ARN du nouveau type de coronavirus 2019 dans les échantillons.Le kit comprend également un système de détection de contrôle interne endogène (sonde génétique de contrôle interne marquée avec CY5) pour surveiller le processus de prélèvement d'échantillons, d'amplification d'ARN et de PCR, réduisant ainsi les résultats faussement négatifs.
Composants principaux
| Composants | Volume（48T/Kit） |
| Solution de réaction RT-PCR | 96 µl |
| Amorce nCOV Mélange de sondes TaqMan (ORF1ab, gène N, gène RnaseP) | 864 µl |
| Contrôle négatif | 1500 µl |
| nCOV Contrôle positif (l ORF1ab N Gene) | 1500 µl |
Réactifs propres : réactifs d’extraction ou de purification d’ARN.Contrôle négatif/positif : le contrôle positif est un ARN contenant le fragment cible, tandis que le contrôle négatif est de l'eau sans acide nucléique.Lors de leur utilisation, ils doivent participer à l’extraction et doivent être considérés comme infectieux.Ils doivent être manipulés et éliminés conformément aux réglementations en vigueur.
Le gène de référence interne est le gène RnaseP humain.
Conditions de stockage et date de péremption
-20 ± 5 ℃, évitez les congélations et décongélations répétées plus de 5 fois, valable 6 mois.
Instrument applicable
Avec FAM/HEX/CY5 et autres instruments PCR fluorescents multicanaux.
Exigences en matière de spécimens
1. Types d'échantillons applicables : écouvillons de gorge, écouvillons nasopharyngés, liquide de lavage broncho-alvéolaire, crachats.
2. Collecte d'échantillons (technique aseptique)
Écouvillon pharyngé : Essuyez les amygdales et la paroi pharyngée postérieure avec deux écouvillons en même temps, puis plongez la tête de l'écouvillon dans un tube à essai contenant la solution d'échantillonnage.
Crachats : après que le patient a une toux profonde, recueillez les crachats toussés dans un tube à essai à bouchon à vis contenant la solution d'échantillonnage ;Liquide de lavage broncho-alvéolaire : prélèvement par des professionnels de la santé.3.Stockage et transport des échantillons
Les échantillons destinés à l’isolement du virus et aux tests d’ARN doivent être testés dès que possible.Les échantillons pouvant être détectés dans les 24 heures peuvent être conservés à 4 ℃ ;ceux qui ne peuvent pas être détectés dans les 24
Les heures doivent être stockées à -70 ℃ ou moins (s'il n'y a pas de condition de stockage de -70 ℃, elles doivent être
temporairement stocké à -20℃réfrigérateur).Les échantillons doivent éviter les congélations et décongélations répétées pendant le transport.Les échantillons doivent être envoyés au laboratoire dès que possible après leur prélèvement.Si les échantillons doivent être transportés sur de longues distances, le stockage sur neige carbonique est recommandé.
Méthodes d'essai
1 Traitement des échantillons et extraction de l'ARN (zone de traitement des échantillons)
Il est recommandé de prélever 200 µl d’échantillon liquide pour l’extraction de l’ARN.Pour les étapes d’extraction associées, reportez-vous aux instructions des kits d’extraction d’ARN commerciaux.Le négatif et le négatif
les contrôles de ce kit ont été impliqués dans l’extraction.
2 Préparation des réactifs PCR (zone de préparation des réactifs)
2.1 Retirez tous les composants du kit, décongelez et mélangez à température ambiante.Centrifuger à 8 000 tr/min pendant quelques secondes avant utilisation ;calculez la quantité requise de réactifs et le système réactionnel est préparé comme indiqué dans le tableau suivant :
| Composants | N portion (système de 25 µl) |
| Mélange de sondes TaqMan pour amorce nCOV | 18 µl × N |
| Solution de réaction RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = nombre d'échantillons testés + 1 (témoin négatif) + 1 (nCOVcontrôle positif) | |
2.2 Après avoir soigneusement mélangé les composants, centrifugez pendant une courte période pour laisser tout le liquide sur la paroi du tube tomber au fond du tube, puis aliquotez les 20 µl du système d'amplification dans le tube PCR.
3 Échantillonnage (zone de préparation des échantillons)
Ajouter 5 µl des contrôles négatifs et positifs après extraction.L'ARN de l'échantillon à tester est ajouté dans le tube de réaction PCR.
Bouchez hermétiquement le tube et centrifugez à 8 000 tr/min pendant quelques secondes avant de le transférer dans la zone de détection d'amplification.
4 Amplification PCR (zone de détection amplifiée)
4.1 Placez le tube de réaction dans la cellule d'échantillon de l'instrument et définissez les paramètres comme suit :
| scène | Faire du vélo nombre | Température(°C) | Temps | collectionsite |
| Inversetranscription | 1 | 42 | 10 minutes | - |
| Pré-dénaturationn | 1 | 95 | 1 minute | - |
| Faire du vélo | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | années 30 | collecte de données |
Sélection du canal de détection de l'instrument : sélectionnez le canal FAM、HEX、CY5 pour le signal de fluorescence.Pour référence fluorescent NONE, veuillez ne pas choisir ROX.
5 Analyse des résultats (veuillez vous référer aux instructions expérimentales de chaque instrument pour le réglage)
Après la réaction, enregistrez les résultats.Après analyse, ajustez la valeur de départ, la valeur de fin et la valeur seuil de la ligne de base en fonction de l'image (l'utilisateur peut ajuster en fonction de la situation réelle, la valeur de départ peut être réglée sur 3 ~ 15, la valeur de fin peut être réglée sur 5~20, réglage) dans le graphique logarithmique Au seuil de la fenêtre, la ligne de seuil est en phase logarithmique et la courbe d'amplification du contrôle négatif est une ligne droite ou en dessous de la ligne de seuil).
6 Contrôle de qualité (Un contrôle procédural est inclus dans le test) Contrôle négatif : Aucune courbe d'amplification évidente pour les canaux de détection FAM, HEX, CY5
Contrôle positif COV : courbe d'amplification évidente des canaux de détection FAM et HEX, valeur Ct≤32, mais pas de courbe d'amplification du canal CY5 ;
Les exigences ci-dessus doivent être remplies simultanément dans la même expérience ;sinon, l’expérience n’est pas valide et doit être répétée.
7 Détermination des résultats.
7.1 S'il n'y a pas de courbe d'amplification ou de valeur Ct > 40 dans les canaux FAM et HEX de l'échantillon testé, et s'il y a une courbe d'amplification dans le canal CY5, on peut juger qu'il n'y a pas de nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) ARN dans l'échantillon ;
.2 Si l'échantillon testé présente des courbes d'amplification évidentes dans les canaux FAM et HEX et que la valeur Ct est ≤40, on peut juger que l'échantillon est positif pour le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si l'échantillon de test présente une courbe d'amplification claire uniquement dans un canal de FAM ou HEX, et que la valeur Ct est ≤ 40 et qu'il n'y a pas de courbe d'amplification dans l'autre canal, les résultats doivent être retestés.Si les résultats du nouveau test sont cohérents, l'échantillon peut être jugé positif au nouveau
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Si le résultat du nouveau test est négatif, on peut juger que l'échantillon est négatif pour le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valeur de jugement positif
La méthode de la courbe ROC est utilisée pour déterminer la valeur CT de référence du kit et la valeur de référence du contrôle interne est de 40.
Interprétation des résultats des tests
1. Chaque expérience doit être testée pour détecter les contrôles négatifs et positifs.Les résultats des tests ne peuvent être déterminés que lorsque les contrôles répondent aux exigences de contrôle qualité
2. Lorsque les canaux de détection FAM et HEX sont positifs, le résultat du canal CY5 (canal de contrôle interne) peut être négatif en raison de la concurrence du système.
3. Lorsque le résultat du contrôle interne est négatif, si les canaux de détection FAM et HEX du tube à essai sont également négatifs, cela signifie que le système est désactivé ou que le fonctionnement est incorrect, le test n'est pas valide.Les échantillons doivent donc être retestés.
