Produits
Kit de détection Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR pour le 2019-nCoV
Utilisation prévue
Ce kit est utilisé pour la détection qualitative du nouveau coronavirus (2019-nCoV) à l'aide d'écouvillons de gorge, d'écouvillons nasopharyngés, de liquide de lavage bronchoalvéolaire, d'expectorations. Le résultat de détection de ce produit est uniquement à titre de référence clinique et ne doit pas être utilisé comme seule preuve pour le diagnostic clinique et le traitement. Une analyse complète de l'état est recommandée en combinaison avec les manifestations cliniques du patient et d'autres tests de laboratoire.
Principe d'inspection
Le kit est basé sur la technologie RT-PCR en une étape. Les gènes ORF1ab et N du nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) ont été sélectionnés comme cibles d'amplification. Des amorces et des sondes fluorescentes spécifiques (les sondes du gène N sont marquées avec FAM et les sondes ORF1ab avec HEX) sont conçues pour détecter l'ARN du nouveau coronavirus 2019 dans les échantillons. Le kit comprend également un système de détection de contrôle interne endogène (sonde du gène de contrôle interne marquée avec CY5) pour surveiller le processus de prélèvement des échantillons, d'amplification de l'ARN et de PCR, réduisant ainsi les faux négatifs.
Composants principaux
| Composants | Volume（48T/Kit） |
| Solution de réaction RT-PCR | 96 µl |
| Amorce nCOV Mélange de sondes TaqMan (ORF1ab, gène N, gène RnaseP) | 864 µl |
| Contrôle négatif | 1500 µl |
| nCOV Contrôle positif (l ORF1ab N Gene) | 1500 µl |
Réactifs propres : réactifs d'extraction ou de purification d'ARN. Contrôle négatif/positif : le contrôle positif est l'ARN contenant le fragment cible, tandis que le contrôle négatif est l'eau exempte d'acide nucléique. Lors de leur utilisation, ils doivent participer à l'extraction et être considérés comme infectieux. Ils doivent être manipulés et éliminés conformément à la réglementation en vigueur.
Le gène de référence interne est le gène RnaseP humain.
Conditions de conservation et date de péremption
-20±5℃, éviter les congélations et décongélations répétées plus de 5 fois, valable 6 mois.
Instrument applicable
Avec FAM / HEX / CY5 et d'autres instruments PCR fluorescents multicanaux.
Exigences relatives aux échantillons
1. Types d'échantillons applicables : écouvillons de gorge, écouvillons nasopharyngés, liquide de lavage bronchoalvéolaire, expectorations.
2. Collecte d'échantillons (technique aseptique)
Écouvillon pharyngé : Essuyez les amygdales et la paroi postérieure du pharynx avec deux écouvillons en même temps, puis plongez la tête de l'écouvillon dans un tube à essai contenant la solution d'échantillonnage
Expectorations : Après une toux profonde du patient, recueillir les expectorations dans un tube à essai à bouchon à vis contenant la solution d'échantillonnage ; liquide de lavage bronchoalvéolaire : Échantillonnage par des professionnels de la santé. 3. Stockage et transport des échantillons
Les échantillons destinés à l'isolement du virus et aux tests d'ARN doivent être testés dès que possible. Les échantillons détectables dans les 24 heures peuvent être conservés à 4 °C ; ceux qui ne le sont pas dans les 24 heures.
heures doivent être stockées à -70℃ ou moins (s'il n'y a pas de condition de stockage à -70℃, elles doivent être
Conserver temporairement au réfrigérateur à -20 °C. Les échantillons doivent être conservés à l'abri des congélations et décongélations répétées pendant le transport. Ils doivent être envoyés au laboratoire dès que possible après leur prélèvement. Si les échantillons doivent être transportés sur de longues distances, un stockage sur glace sèche est recommandé.
Méthodes d'essai
1 Traitement des échantillons et extraction d'ARN (zone de traitement des échantillons)
Il est recommandé de prélever 200 μl d'échantillon liquide pour l'extraction de l'ARN. Pour les étapes d'extraction correspondantes, reportez-vous aux instructions des kits d'extraction d'ARN commerciaux. Les résultats négatifs et négatifs
les témoins de ce kit ont été impliqués dans l'extraction.
2 Préparation des réactifs PCR (zone de préparation des réactifs)
2.1 Retirer tous les composants du kit, les décongeler et les mélanger à température ambiante. Centrifuger à 8 000 tr/min pendant quelques secondes avant utilisation ; calculer la quantité de réactifs requise et préparer le système réactionnel comme indiqué dans le tableau suivant :
| Composants | Portion N (système de 25 µl) |
| Mélange de sondes TaqMan pour amorce nCOV | 18 µl × N |
| Solution de réaction RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = nombre d'échantillons testés + 1 (témoin négatif) + 1 (nCOVcontrôle positif) | |
2.2 Après avoir soigneusement mélangé les composants, centrifugez pendant une courte période pour laisser tout le liquide sur la paroi du tube tomber au fond du tube, puis aliquotez le système d'amplification de 20 µl dans le tube PCR.
3 Échantillonnage (zone de préparation des échantillons)
Ajouter 5 μl des contrôles négatif et positif après extraction. L'ARN de l'échantillon à tester est ajouté au tube de réaction PCR.
Fermez hermétiquement le tube et centrifugez à 8 000 tr/min pendant quelques secondes avant de le transférer dans la zone de détection d'amplification.
4 Amplification PCR (zone de détection amplifiée)
4.1 Placez le tube de réaction dans la cellule d'échantillon de l'instrument et définissez les paramètres comme suit :
| scène | Faire du vélo nombre | Température(°C) | Temps | collectionsite |
| Inversetranscription | 1 | 42 | 10 minutes | - |
| Pré-dénaturationn | 1 | 95 | 1 min | - |
| Faire du vélo | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | années 30 | collecte de données |
Sélection du canal de détection de l'instrument : sélectionnez les canaux FAM, HEX et CY5 pour le signal de fluorescence. Pour une fluorescence de référence nulle, ne sélectionnez pas ROX.
5 Analyse des résultats (Veuillez vous référer aux instructions expérimentales de chaque instrument pour le réglage)
Après la réaction, enregistrez les résultats. Après l'analyse, ajustez la valeur initiale, la valeur finale et la valeur seuil de la ligne de base en fonction de l'image (l'utilisateur peut ajuster en fonction de la situation réelle, la valeur initiale peut être définie entre 3 et 15, la valeur finale entre 5 et 20, ajustement) dans le graphique logarithmique. Au seuil de la fenêtre, la ligne de seuil est en phase logarithmique et la courbe d'amplification du contrôle négatif est une ligne droite ou inférieure à la ligne de seuil.
6 Contrôle de qualité (un contrôle procédural est inclus dans le test) Contrôle négatif : aucune courbe d'amplification évidente pour les canaux de détection FAM, HEX, CY5
Contrôle positif COV : courbe d'amplification évidente des canaux de détection FAM et HEX, valeur Ct ≤ 32, mais pas de courbe d'amplification du canal CY5 ;
Les exigences ci-dessus doivent être satisfaites simultanément dans la même expérience ; sinon, l'expérience est invalide et doit être répétée.
7 Détermination des résultats.
7.1 S'il n'y a pas de courbe d'amplification ou de valeur Ct > 40 dans les canaux FAM et HEX de l'échantillon de test, et qu'il y a une courbe d'amplification dans le canal CY5, on peut juger qu'il n'y a pas d'ARN du nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV) dans l'échantillon ;
.2 Si l'échantillon de test présente des courbes d'amplification évidentes dans les canaux FAM et HEX et que la valeur Ct est ≤ 40, on peut juger que l'échantillon est positif pour le nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si l'échantillon testé présente une courbe d'amplification nette sur un seul canal FAM ou HEX, que la valeur Ct est ≤ 40 et qu'il n'y a pas de courbe d'amplification sur l'autre canal, les résultats doivent être retestés. Si les résultats sont cohérents, l'échantillon peut être jugé positif pour le nouveau canal.
Coronavirus 2019 (2019-nCoV). Si le résultat du nouveau test est négatif, on peut conclure que l'échantillon est négatif au nouveau coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valeur de jugement positive
La méthode de la courbe ROC est utilisée pour déterminer la valeur CT de référence du kit et la valeur de référence du contrôle interne est de 40.
Interprétation des résultats des tests
1. Chaque expérience doit être testée pour les contrôles négatifs et positifs. Les résultats des tests ne peuvent être obtenus que si les contrôles satisfont aux exigences de contrôle qualité.
2. Lorsque les canaux de détection FAM et HEX sont positifs, le résultat du canal CY5 (canal de contrôle interne) peut être négatif en raison de la concurrence du système.
3. Lorsque le résultat du contrôle interne est négatif, si les canaux de détection FAM et HEX du tube à essai sont également négatifs, cela signifie que le système est désactivé ou que le fonctionnement est incorrect ; le test est alors invalide. Par conséquent, les échantillons doivent être retestés.
